콩과 식물인 Lotus japonicus의 TILLING 역유전학 도구 및 웹 접근 가능한 변이체 모음

역유전학은 이미 알려진 서열을 가진 유전자의 기능을 해당 유전자의 기능이 손상된 세포나 유기체의 표현형 분석을 통해 식별하는 것을 목표로 합니다. 역유전학에 일반적으로 사용되는 전략에는 전위인자 돌연변이 유도(Tissier et al., 1999)와 RNA 매개 유전자 억제 또는 RNA 간섭(Voinnet, 2002)이 포함됩니다. 우리는 에틸 메탄설폰산(EMS)으로 돌연변이를 유도한 M2 식물 대규모 집단에서 관심 있는 어느 유전자의 점 돌연변이를 가진 개체를 식별하는 역유전학 도구를 설정하기 위해 보완 전략을 채택했습니다. 이 전략은 McCallum et al. (2000a,b)에서 TILLING(타겟 유도 국소 병변)이라는 약어를 사용하여 처음 설명되었습니다. 목표 서Sequence는 풀링된 M2 개체에서 PCR 증폭됩니다. 점 돌연변이를 가진 DNA는 PCR 결과물의 용융 및 재어닐링을 통해 검출됩니다. 이로 인해 하나의 가닥은 돌연변이에 의해 유래하고 다른 가닥은 야생형 PCR 결과물에서 유래한 이형 이중가닥 DNA가 형성됩니다. 점 돌연변이가 발생한 위치에서 불일치가 발생하며, 이는 셀러리(Celery; Apium graveolens)의 CEL I와 같은 불일치 특정 제한 효소를 사용하여 검출할 수 있습니다(Yang et al., 2000). 이 효소는 이형 이중가닥 DNA의 불일치를 인식하고 불일치가 있는 위치에서 DNA를 특이적으로 절단합니다. 절단된 생성물은 일반적으로 시퀀싱형 변성 PAGE를 사용하는 겔 전기영동으로 분리할 수 있습니다. 이 방법은 풀링 전략에 유리합니다. 아라비도프시스 TILLING 시설에서는 여덟 개의 M2 식물의 DNA를 혼합하여 풀을 형성합니다(Colbert et al., 2001). 이 풀 크기에서 768개의 개체 집단을 PCR을 통해 96개 공간의 마이크로타이터 플레이트에서 선별할 수 있으며, 하나의 96개 젤에서 실행할 수 있으며, 각 공간은 여덟 개체를 대표합니다. 절단 생성물을 생성하는 풀에서 개체들이 각각 PCR로 증폭되어 돌연변이를 가진 식물을 식별하고, 이 식물의 자손은 관심 있는 돌연변이를 분리하게 됩니다.