세포 외 소포 분리에 대한 최적화 및 크기 배제 크로마토그래피를 통한 지질단백질(Lipoprotein) 분리

질병 바이오마커로서 세포 외 소포(EV)의 사용에 대한 관심이 빠르게 커지고 있다. 그러나 EV 분야에서 해결되지 않은 주요 문제 중 하나는 생체 유체 샘플에 존재하는 비-EV 오염 물질을 원스텝 분리 프로토콜로 제거할 수 있는 기술을 찾는 것이다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 확장성과 가치로 인해 최상의 EV 분리 방법 중 하나로 알려져, 우리는 다양한 아가로스 비율, 비드 크기 및 교차 결합 특성을 가진 여러 아가로스 수지를 테스트 하여 EV 분리를 최적화하였다. SEC 최적화를 위해 우리는 멜라노마 세포 배양에서 조건화된 매체를 사용하였으며, 이는 생물학적 유체에 비해 간단한 샘플이지만 용해성 단백질 및 지질단백질(LPP)과 같은 풍부한 오염 물질을 포함하고 있다. 서로 다른 아가로스와 동일한 컬럼에서 서로 다른 아가로스 비율을 가진 수지 조합을 테스트 하였다. 다양한 용출 분획에서 용해성 단백질, EV 및 LPP 수치를 면역 검출 또는 흡광도 측정을 통해 정량화하였다. 샘플은 또한 NTA 및 TEM을 통해 수율과 LPP 오염을 검증하였다. 서로 다른 비율의 아가로스 수지(2%, 4% 및 6%)는 각각 증가하는 LPP 오염을 가진 샘플을 생성하였으며, 이를 결합한 컬럼에서는 개선되지 않았다. 아가로스의 교차 결합은 EV 분리 수율이나 LPP 오염에 영향을 미치지 않았다. 반대로, 비드 크기를 줄이는 것은 EV 순도를 크게 향상시켰다. 따라서 우리는 거의 다른 입자의 오염 없이 EV를 보다 효율적으로 분리하는 4% Rapid Run Fine 아가로스 비드를 수지로 선택하였다. 혈장 샘플을 사용하여, 이 수지는 또한 해당 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 아가로스와 차등 초원심침강법에 비해 LPP로부터 EV를 분리하는 개선된 능력을 보여주었다.