استخدام استبدالات موقع الفوسفور لتحليل الأهمية البيولوجية لحدث الفسفرة في الشبكات التنظيمية

غالباً ما تُنقل المعلومات البيولوجية بواسطة cascades الفسفرة. ومع ذلك، فإن الأهمية البيولوجية للأحداث الفسفورية المحددة غالباً ما يكون من الصعب تحديدها. أداة لا تقدر بثمن لدراسة تأثير الكينازات و/أو الفوسفاتازات هي استخدام استبدالات mimetic الفسفو-و dephospho في البروتينات المستهدفة المعنية. هنا، نقدم إجراءً قابلاً للتطبيق عمومًا حول كيفية تصميم وإعداد وتنفيذ تجارب تعديل الفسفرة والمراقبة اللاحقة للأنشطة البروتينية، مع أخذ الكينازات المعتمدة على -السايكلين (CDKs) كدراسة حالة. تعتبر CDKs منظمين رئيسيين لتقدم دورة الخلية في جميع الخلايا حقيقية النواة. وبالتالي، يتم التحكم في CDKs على عدة مستويات وتُستخدم فسفرة CDKs -نفسها لتنظيم نشاط الكيناز الخاص بها. نصف بالتفصيل تجارب التكامل لطفرة في CDKA;1، الكيناز الرئيسي لدورة الخلية في Arabidopsis، مع متغيرات موقع الفسفرة لـ CDKA;1. تم إنشاء نسخ CDKA;1 إما عن طريق محاكاة حمض أميني مفسفر عن طريق استبدال البقايا المعنية بحمض أميني مشحون سلبًا، مثل الأسبارتات أو الغلوتامات، أو عن طريق تحويره إلى حمض أميني غير قابل للفسفرة، مثل الألانين أو الفالين أو الفينيل ألانين. رافقت الدراسات الجينية للتكامل عزل هذه المتغيرات الكيناز من مستخلص النبات وإجراء اختبارات الكيناز اللاحقة لتحديد التغيرات في مستويات نشاطها. سمح لنا هذا العمل بتقدير أهمية -التحكم بعد الترجمة لـ CDKA;1 في النباتات وأظهر أن الآليات الجزيئية لوظيفة CDK محفوظة على ما يبدو عبر الممالك. ومع ذلك، فإن الأسلاك التنظيمية لـ CDKs تختلف بشكل لافت بين النباتات والحيوانات والخميرة.