Tasas de error para la discriminación de nanoporo entre citosina, 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina a lo largo de hebras individuales de ADN

Se identificaron citosina, 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina durante la translocación de hebras de ADN plantilla individuales a través de un poro de Mycobacterium smegmatis modificado (M2MspA) bajo el control de la ADN polimerasa phi29. Esta identificación se basó en tres estados de corriente iónica consecutivos que corresponden al paso de dinucleótidos CG modificados o no modificados y sus vecinos inmediatos a través de la apertura limitante del nanoporo. Para establecer puntuaciones de calidad para estas llamadas, examinamos ~3,300 eventos de translocación para 48 construcciones de ADN distintas. Cada experimento analizó una mezcla de hebras de ADN que contenían citosina, 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina, que contenía un marcador que establecía de manera independiente el estado correcto de metilación de citosina en el CG objetivo de cada molécula probada. Para calcular las tasas de error para estas llamadas, establecimos límites de decisión utilizando una variedad de métodos de aprendizaje automático. Estas tasas de error dependieron de la identidad de las bases inmediatamente 5' y 3' del dinucleótido CG objetivo, y variaron del 1.7% al 12.2% para una lectura de paso único. Estimamos que se podrían alcanzar valores Q40 (0.01% de tasas de error) para las llamadas de estado de metilación leyendo moléculas individuales entre 5 y 19 veces dependiendo del contexto de la secuencia.