Ensambaje y modificación rápida de vías metabólicas utilizando la recombinación específica de sitios de integrasa de serina

La biología sintética requiere métodos efectivos para ensamblar partes de ADN en dispositivos y para modificar estos dispositivos una vez creados. Aquí demostramos un procedimiento rápido y conveniente para el ensamblaje de fragmentos de ADN utilizando recombinación específica de sitios mediada por la integrasa C31. Usando seis pares de sitios de recombinación attP/attB ortogonales con diferentes secuencias de solapamiento, podemos ensamblar hasta cinco fragmentos de ADN en un orden definido e insertarlos en un vector plasmídico en una sola reacción de recombinación. El ensamblaje mediado por integrasa C31 es altamente eficiente, permitiendo la producción de grandes bibliotecas adecuadas para estrategias combinatorias de ensamblaje de genes. Los ensamblajes resultantes contienen arreglos de casetes de ADN separados por sitios de recombinación, que se pueden usar para manipular el ensamblaje mediante una recombinación adicional. Ilustramos la utilidad de estos procedimientos para (i) ensamblar vías metabólicas funcionales que contienen tres, cuatro o cinco genes; (ii) optimizar la productividad de dos vías metabólicas modelo mediante ensamblaje combinatorio con aleatorización del orden de los genes o la fuerza del sitio de unión del ribosoma; y (iii) modificar una vía metabólica ensamblada mediante reemplazo o adición de genes.