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O rastreamento espacial e temporal de proteínas fluorescentes (PFs) em células vivas permite a visualização da remodelação do proteoma em resposta a sinais extracelulares. Historicamente, a dinâmica das proteínas durante o tráfego foi visualizada utilizando PFs ativas constitutivamente fundidas a proteínas de interesse. Embora poderosos, esses PFs rotulam todos os reservatórios celulares de uma proteína, potencialmente ocultando a dinâmica de subpopulações selecionadas. Para ajudar a estudar subpopulações de proteínas, foram desenvolvidas etiquetas de bioconjugados, incluindo as proteínas de ativação de fluorógeno (PAFs). As PAFs são compostas por dois componentes: um anticorpo de cadeia única (ACS) fundido à proteína de interesse e um derivado de verde malaquita (VM), que fluoresce apenas quando ligado ao ACS. Importante, os derivados de VM podem ser permeáveis ou impermeáveis às células, permitindo assim a detecção isolada de proteínas marcadas por ACS na superfície celular e facilitando medidas endocíticas quantitativas. Para expandir o uso das PAFs em leveduras, otimizamos o ACS para expressão em leveduras, criamos plasmídeos de marcação por PAF e geramos marcadores de organelas marcados por PAF. Para demonstrar a eficácia da PAF, acoplamos o ACS ao receptor acoplado à proteína G Ste3 de levedura. Medimos a dinâmica endocítica do Ste3 em resposta a feromônio e caracterizamos.
Oppenheimer et al. (Qua,) estudaram esta questão.