Caracterização de mutantes microalgais deficientes em carotenoides, knockout de fitona desaturase gerados por complexos de ribonucleoproteínas Cas9.

A fitona desaturase (PDS; EC 1.3.5.5) é uma enzima chave do caminho biossintético de carotenoides, catalisando a desaturação da fitona, precursor de todos os carotenoides. Neste estudo, foram gerados vários transformantes knockout de PDS (PDS-KO) da microalga clorófita Chlamydomonas reinhardtii utilizando uma estratégia de genética reversa. Dois RNAs guias únicos (sgRNA) foram projetados para direcionar o primeiro éxon do gene PDS, e complexos de ribonucleoproteínas Cas9 (RNPs) pré-montados foram entregues nos núcleos microalgal por eletroporação. Múltiplos transformantes PDS-KO brancos foram obtidos com sucesso através dessa abordagem, e três linhagens de transformantes independentes foram subsequentemente caracterizadas. Ao integrar análises ultraestruturais, de pigmentos e transcriptômicas de células cultivadas no escuro de vários mutantes deficientes em carotenoides PDS-KO em comparação com a cepa parental, foi demonstrado que os carotenoides são componentes indispensáveis de múltiplas arquiteturas celulares. A análise cromatográfica confirmou que o único carotenoide acumulado nesses transformantes foi a fitona, que carece das funções estruturais críticas e fotoprotectoras de seus derivados coloridos. Observações por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) revelaram alterações profundas na ultraestrutura, incluindo cloroplastos mal desenvolvidos e efeitos em outras estruturas celulares que estavam ausentes ou severamente desorganizadas. De forma consistente, a agrupamento de genes diferencialmente expressos em grupos funcionais revelou a desregulação de vias associadas à fotossíntese, biossíntese de clorofila e carotenoides, biogênese de ribossomos e tráfego de vesículas e membranas nas linhagens PDS-KO. Em contrapartida, foi observada a regulação positiva de genes regulatórios e indutores de retrotransposons. Essas descobertas sublinham o papel metabólico central dos carotenoides coloridos nas células vegetais, destacando sua contribuição essencial para a homeostase celular e a competência fotossintética.