Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine zentrale Rolle in zellulären Redoxprozessen. Während kontrollierte ROS-Konzentrationen an physiologischen Signalprozessen beteiligt sind, führt eine übermäßige ROS-Bildung zur Störung der Redoxhomöostase und zu oxidativem Stress, der mit zellulärer Dysfunktion und Schädigung einhergeht. Ein zentraler Mechanismus der Redoxsignalübertragung beruht auf reversiblen oxidativen posttranslationalen Modifikationen (oxPTMs) an Cysteinresten in Proteinen. Aufgrund der hohen Reaktivität von Cystein-Thiolgruppen sind diese besonders anfällig für oxidative Modifikationen, die als regulatorische Redox-Schalter fungieren können und dadurch Proteinaktivität, Struktur und Interaktionen modulieren. Eine umfassende Charakterisierung der Redoxzustände von Cysteinen ist daher entscheidend für das Verständnis redoxabhängiger zellulärer Regulationsmechanismen. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Anwendung eines massenspektrometriebasierten Redox-Proteomik-Workflows zur Analyse cysteinspezifischer Modifikationen in zellulären Systemen sowie dessen Bewertung hinsichtlich der Erfassbarkeit des zellulären Redoxproteoms unter definierten experimentellen Bedingungen. Hierzu wurde eine Differentialalkylierungsstrategie unter Verwendung von N-Ethylmaleimid (NEM) und isotopenmarkiertem d5-NEM etabliert, die eine Unterscheidung zwischen reduzierten und reversibel oxidierten Cysteinresten innerhalb eines Bottom-up-Proteomik-Ansatzes ermöglicht. Der entwickelte Workflow wurde zunächst anhand einer definierten Proteinmischung validiert, um Markierungseffizienz, Spezifität und technische Robustheit zu beurteilen, und anschließend auf SW480-Kolonkarzinomzellen sowie Detroit-551-Fibroblasten angewendet. Oxidativer Stress wurde durch tert-Butylhydroperoxid (TBHP) und Arsentrioxid (ATO) induziert. Nach der Behandlung wurden die Gesamtzelllysate differentiell alkyliert, enzymatisch verdaut und anschließend mittels Nano-Flüssigchromatographie gekoppelt an Tandem-Massenspektrometrie (NanoLC-MS/MS) auf einem timsTOF Pro analysiert. Die proteomweite Analyse zeigte behandlungsabhängige Unterschiede in der zellulären Antwort auf oxidative Perturbationen. Während die Behandlung mit TBHP unter den getesteten Bedingungen nur geringe proteomische Veränderungen zeigte, führte die Behandlung mit ATO zu signifikanten Veränderungen der Proteinabundanz. Peptidbasierte Analysen ermöglichten die gleichzeitige Untersuchung von Cystein-Redoxzuständen und Veränderungen der Proteinabundanz und zeigten, dass Redoxregulation in hohem Maße positionsspezifisch erfolgt und nicht durch eine gleichmäßige Oxidation des gesamten Proteoms beschrieben werden kann. Durch die kombinierte Analyse auf Protein- und Peptidebene der ATO-Behandlung wurde die Überlappung zwischen signifikant regulierten Proteinen und ATO-spezifischen unique Peptiden untersucht, woraus Hitzeschockproteine sowie Komponenten des Pentosephosphatwegs für eine detaillierte Redoxcharakterisierung ausgewählt wurden. Insgesamt etabliert und bewertet diese Arbeit einen auf Differentialalkylierung basierenden Redox-Proteomik-Workflow, der mit globalen Proteomanalysen kompatibel ist, und demonstriert dessen Anwendbarkeit zur Untersuchung cysteinzentrierter Redoxregulation in zellulären Systemen. Der Ansatz ermöglicht die Verknüpfung cysteinspezifischer Redoxmodifikationen mit funktionellen zellulären Antworten auf oxidativen Stress.
Valentina Heuschneider (Thu,) studied this question.