Unzählige intrazelluläre Mechanismen regulieren zelluläre Antworten. Ein Mechanismus erfolgt durch Botenstoffe wie Inositolpolyphosphate (InsPs) und Inositolpyrophosphate (PP-InsPs), eine einzigartige Klasse dicht geladener kleiner Moleküle. Ein anderer umfasst posttranslationale Proteinmodifikationen wie Proteinpyrophosphorylierung. Diese Arbeit umfasst zwei Teile, die sowohl InsP-vermittelte Signalübertragung als auch Proteinpyrophosphorylierung erforschen. Der erste Teil fokussiert auf den Metabolismus von Inositol-(1,4,5)-trisphosphat (Ins(1,4,5)P₃), einer der weitesten untersuchten InsP-Spezies. Um Herausforderungen der Überwachung seines In-vitro-Metabolismus zu überwinden, wurde ¹³C6Ins(1,4,5)P₃ aus 13C6Ins(1,3,4,5,6)P₅ mit Multiple-Inositol-Polyphosphat-Phosphatase 1 (MINPP1) semienzymatisch synthetisiert. Dieses Werkzeug ermöglichte Neuuntersuchung der Phosphatase- und Kinaseaktivitäten bekannter und annotierter Enzyme mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) und Massenspektrometrie (MS). Außerdem wurde die Aktivität einer putativen Kinase aus der Alge Klebsormidium nitens annotiert. Das zweite Projekt fokussiert auf Werkzeugentwicklung zur Synthese pyrophosphorylierter Proteine. Als Antwort auf das Versagen des Amber-Codon-Suppressionswegs zur Erzeugung pyrophosphorylierten Sub1-Proteins wurde ein nativer chemischer Ligations (NCL)-Ansatz gewählt. Nach der NCL-Methode konnten ortsspezifisch modifiziertes Sub1 (Aminosäure 2-Aminosäure 43) und sogar vollständiges Sub1 erfolgreich erzeugt werden. Zur weiteren Expansion der chemischen Proteinsynthese wurde ein Serin-Threonin-Ligations (STL)-Weg initiiert und Zwischenprodukte erfolgreich detektiert. Zusätzlich wurde Kompatibilität C-terminal Salicylaldehyd-Ester-derivatisierter Peptide mit einer Phosphorimidazolid-basierten Pyrophosphorylierungsmethode demonstriert. Dieses Projekt eröffnet Wege zur Erzeugung pyrophosphorylierter Proteine mittels chemischer Proteinsynthese.
Atharva Vijaykumar Patharkar (Thu,) studied this question.