Caracterização dos pequenos RNAs carregados por vesículas de membrana externa produzidas por Escherichia coli produtora de toxina Shiga positiva para hlyF

Escherichia coli (STEC) produtora de toxina Shiga (Stx) que abriga determinantes de virulência de E. coli patogênica extraintestinal (ExPEC) está emergindo na Europa como uma causa de doença severa. Entre as características da ExPEC identificadas em STEC, o gene hlyF está associado a uma produção aumentada de vesículas de membrana externa (OMV). As OMVs produzidas por cepas de E. coli mostraram entregar toxinas e pequenos RNAs, mas as informações sobre este último componente genético ainda são escassas. Investigamos os pequenos RNAs contidos nas OMVs produzidas por duas cepas de STEC positivas para hlyF que produzem Stx2, pertencentes aos sorotipos O26: H11 e O80: H2, isoladas de um caso humano de Síndrome Hemolítica-Urêmica (HUS) e de uma amostra de leite, respectivamente. As OMVs foram purificadas a partir de culturas overnight utilizando dois passos sequenciais de ultracentrifugação a 100.000 e 200.000 x g por 2h cada. As OMVs coletadas foram analisadas por Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA) e Microscopia Eletrônica (EM) para definir sua morfologia, tamanho e concentração. As sequências do genoma completo das duas cepas de teste e de três cepas adicionais de STEC positivas para hlyF foram analisadas para identificar sequências de pequenos RNAs. Ensaios específicos de PCR em Tempo Real foram implementados para detectar os pequenos RNAs dentro das OMVs. A caracterização por EM e NTA confirmou a presença de partículas esféricas e mostrou que uma preparação mais limpa foi obtida após o segundo passo de ultracentrifugação (200.000 x g). Identificamos as sequências de 27 pequenos RNAs putativos presentes no genoma das cepas de STEC positivas para hlyF e ausentes no de uma E. coli não patogênica. Nove deles foram identificados e quantificados nas OMVs produzidas pelas duas cepas de teste. Um papel regulatório na replicação de DNA bacteriano, integração e na resposta ao estresse foi hipotetizado para os pequenos RNAs identificados, alguns dos quais abrangem todos os domínios da vida. STnc₁00 foi o único pequeno RNA identificado nas OMVs produzidas por ambas as cepas. Curiosamente, uma cópia da sequência de STnc₁00 está localizada a jusante do operon stx2 carregado por fágicas codificadoras de Stx2 em ambas as cepas e possui uma região de complementaridade para o gene stxB, sugerindo uma modulação na produção ou liberação de Stx. Nossos resultados indicam que a liberação de OMVs pode exercer funções regulatórias, presumivelmente influenciando a comunicação entre o hospedeiro e a microbiota intestinal durante o processo de infecção.