Resumo Apesar dos avanços recentes na aquisição de dados e desenvolvimento de algoritmos, aplicar a microscopia eletrônica de crio (cryoEM) a pequenas proteínas (<50kDa) continua sendo desafiador, mesmo quando dados de alta qualidade estão disponíveis, em parte devido à falta de características estruturais de baixa resolução confiáveis para informar os alinhamentos iniciais. Aqui apresentamos um fluxo de trabalho que contorna efetivamente esta etapa, obtendo orientações iniciais das partículas diretamente da reconstrução ab initio heterogênea no CryoSPARC, utilizando apenas dados em altas frequências espaciais. Aplicando esta abordagem, resolvemos a estrutura de uma proteína anteriormente intratável em um conjunto de dados publicamente disponível, iPKAc (EMPIAR-10252), 39 kDa, resolvida em uma resolução estimada de 2,7 Å, assim como um dímero de hemoglobina alfa-beta (EMPIAR-10250) a 29kDa, resolvido para uma resolução estimada de 4 Å. Também mostramos que o complexo Aca2-RNA (37kDa, EMPIAR-11918) pode ser resolvido por esta abordagem diretamente de um lote de partículas escolhidas, em uma única rodada de reconstrução ab initio heterogênea seguida por refinamento local. O mapa de iPKAc é de qualidade suficiente para auto-construir 325 dos 356 resíduos presentes na estrutura cristalina original usando Modelangelo, e íons de ATP e magnésio ordenados podem ser claramente resolvidos. O dímero de Hb apresenta características estruturais secundárias claras, hemes identificáveis e cadeias laterais volumosas visíveis, consistentes com a resolução estimada. Esperamos que esta abordagem possa ser útil para a análise por cryo-EM de outras partículas pequenas próximas ou abaixo do limite teórico de tamanho.
Kim et al. (Sex,) estudaram essa questão.