A rotulagem de spin não covalente dos canais iônicos TRPC5 permite estudos de EPR sobre interações proteína-ligante

A espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica (EPR) é uma técnica poderosa para o estudo de proteínas em solução e sob condições nativas. Centros de spin paramagnéticos são geralmente introduzidos por rotulagem de spin direcionada ao local (SDSL) de resíduos de cisteína engenheirados. No entanto, para muitas classes de proteínas (de membrana), a engenharia de cisteínas não é possível sem afetar sua integridade estrutural e funcional. Neste trabalho, relatamos o desenvolvimento de sondas de spin baseadas em xantina que permitem a rotulagem de spin não covalente dos canais iônicos humanos TRPC5. Os compostos mantiveram alta potência como moduladores de TRPC5 e permitiram a avaliação da interação entre ligantes e distâncias inter-ligantes por EPR de onda contínua (CW EPR) e espectroscopia de ressonância dupla elétron-elétron (DEER). Os resultados dos experimentos de EPR foram suportados por estruturas de criomicroscopia eletrônica de alta resolução (cryoEM) dos complexos TRPC5:sonda de spin. Este trabalho demonstra que a rotulagem de spin não covalente, baseada em ligantes, pode ser usada para estudos de EPR de grandes proteínas de membrana ricas em cisteína e seus complexos.