Triagem de genes de referência confiáveis para a normalização de RT-qPCR em tecidos de fígado de frango e células LMH

O fígado desempenha um papel vital na síntese e metabolismo de lipídios em aves. Para estudar os genes funcionais de forma mais eficaz, é essencial realizar a triagem de genes de referência confiáveis no fígado de frango, incluindo fêmeas, machos, embriões, bem como na linha celular Leghorn Male Hepatoma (LMH). A triagem tradicional de genes de referência envolve a seleção de genes de casa comumente utilizados (HKGs) para experimentos de RT-qPCR e a utilização de diferentes algoritmos para identificar os mais estáveis. No entanto, essa abordagem é limitada na seleção do melhor gene de referência a partir de um pequeno grupo de HKGs. A tecnologia de sequenciamento de alto rendimento pode oferecer uma solução para essa limitação. Este estudo teve como objetivo identificar os genes mais consistentemente expressos, utilizando múltiplos dados publicados de RNA-seq de fígado de frango e células LMH. Subsequentemente, a estabilidade dos novos genes de referência identificados foi avaliada em comparação com genes de referência previamente validados como estáveis, expressos em fígado de aves e os HKGs comumente utilizados, utilizando RT-qPCR. Os resultados indicaram que há um maior grau de semelhança em genes de expressão estável entre fígados de fêmeas e machos (como LSM14A e CDC40). No fígado embrionário, os novos genes de referência ótimos foram SUDS3, TRIM33 e ERAL1. Para as células LMH, os genes de referência ótimos foram ALDH9A1, UGGT1 e C21H1orf174. No entanto, é importante notar que a maioria dos HKGs não apresentou expressão estável em múltiplas amostras, indicando uma potencial instabilidade sob diversas condições. Além disso, experimentos de RT-qPCR provaram que os genes de expressão estável identificados a partir dos dados de RNA-seq superaram os HKGs comumente utilizados e certos genes de referência validados específicos para o fígado de aves. No geral, este estudo identificou com sucesso novos genes de referência estáveis no fígado de frango e nas células LMH utilizando dados de RNA-seq, oferecendo aos pesquisadores uma gama mais ampla de opções de genes de referência para RT-qPCR em diversas situações.