Estudos funcionais sobre módulos de ligação a carboidratos em tandem de uma enzima multimodular com dois domínios catalíticos

Embora estudos funcionais sobre módulos de ligação a carboidratos (CBM) tenham sido realizados extensivamente, o papel dos CBMs em tandem na enzima contendo múltiplos domínios catalíticos (CDs) é incerto. Aqui, identificamos uma enzima multidomínio (Lc25986) com uma nova estrutura modular proveniente de um consórcio bacteriano lignocelulolítico. Consiste em um domínio mannanase, dois domínios CBM65 (LcCBM65-1/LcCBM65-2) e um domínio esterase. Para investigar a função do CBM e as interações dos domínios, a Lc25986 de comprimento total e suas variantes foram construídas e utilizadas para análises de atividade enzimática, ligação e bioinformática. Os resultados mostraram que LcCBM65-1 e LcCBM65-2 se ligam a manano e xiloglucano, mas não à celulose ou β-1,3-1,4-glucano, o que difere da especificidade de ligante dos CBM65 relatados. Comparado a LcCBM65-2, LcCBM65-1 apresentou uma afinidade mais forte por ligantes e uma preferência por locais de acetilação. Ambos os CBM65 estimularam as atividades enzimáticas de seus respectivos CDs vizinhos contra manano acetilado, mas não contribuíram para as atividades dos CDs distais. O curso temporal da hidrólise do manano indicou que a Lc25986 de comprimento total foi mais eficaz na degradação completa de substratos mistos acetil/não acetil do que a mistura de mutantes de CD único. Ao atuar em substratos complexos, LcCBM65-1 não apenas melhorou a atividade enzimática do domínio mannanase, mas também direcionou o domínio esterase para os polissacarídeos acetilados. LcCBM65-2 adotou uma baixa afinidade para reduzir a interferência na catálise do domínio mannanase. Esses resultados demonstram a importância dos CBMs para o sinergismo entre os dois CDs de uma enzima multidomínio e sugerem que eles contribuem para a degradação adequada de substratos complexos, como paredes celulares vegetais.