Passos Iniciais na Biossíntese de Metanobactina: Ligação de Substrato pelo Enzima Di-ferro de Valência Mista MbnBC

O complexo enzimático MbnBC converte resíduos de cisteína em um substrato peptídico, MbnA, em grupos oxazolina/tioamida durante a biossíntese do quelante de cobre metanobactina (Mbn). MbnBC pertence à família de oxigenases di-ferro de valência mista (MVDO), cujos membros utilizam um cofator Fe(II)Fe(III) para reagir com o dióxido de oxigênio na modificação do substrato. Várias estruturas cristalinas da forma inativa Fe(III)Fe(III) de MbnBC sozinha e em complexo com MbnA foram relatadas, mas uma compreensão mecanicista requer a determinação dos estados de oxidação dos íons de Fe observados cristalograficamente no estado cataliticamente ativo Fe(II)Fe(III), juntamente com o local de ligação do MbnA. Aqui, utilizamos espectroscopia de ressonância nuclear eletrônica de dupla ressonância (ENDOR) para determinar propriedades estruturais e eletrônicas do sítio ativo, em particular, o modo de ligação do substrato ao estado MV, informação não acessível apenas pela cristalografia de raios X. Os estados de oxidação dos dois íons de Fe foram determinados por análise ENDOR de 15N. A presença e as localizações tanto de ligantes solventes exógenos de ponte quanto terminais foram determinadas usando 1H e 2H ENDOR. Além disso, o 2H ENDOR utilizando um substrato MbnA rotulado isotopicamente indica que MbnA se liga ao íon Fe(III) do cluster via o átomo de enxofre de seu resíduo de cisteína modificável na extremidade N-terminal, com deslocamento de um ligante solvente coordenado como mostrado pelo 1H ENDOR complementar. Esses resultados, que enfatizam a utilidade do ENDOR no estudo dos MVDOs, fornecem uma imagem molecular dos primeiros passos na biossíntese de Mbn.