Imagem Raman dinâmica melhorada por azo da fisiologia de organelas celulares

A espectroscopia Raman reflete impressões digitais vibracionais moleculares de bandas extremamente estreitas. Assim, a microscopia Raman é bem conhecida por oferecer uma solução atraente para a imagem celular multiplex. No entanto, apesar da capacidade multiplex, a imagem Raman nunca se aproximou do sonho de observar dinâmicas celulares de alta velocidade que são verdadeiramente significativas para estudos biológicos, devido ao gargalo fundamental da baixa intensidade dos sinais de espalhamento Raman. Mesmo com técnicas Raman altamente avançadas, como a microscopia de espalhamento Raman estimulado (SRS), os pesquisadores raramente conseguiram imagens dinâmicas ou a um custo muito alto de potências laser e sistemas complexos, além de sacrificar a informação de espectro completo, que é a grande vantagem da espectroscopia Raman. Este manuscrito resume nossos esforços na melhoria da imagem Raman espontânea de alta qualidade, que foram recentemente publicadas em periódicos de alto impacto. Combinamos sondas de espalhamento Raman melhoradas por azo (AERS) novas com um sistema de imagem de linha de varredura Raman altamente eficiente e otimizado para velocidade. As sondas AERS visaram organelas celulares e apresentaram sinais Raman livres de fundo com força 4 ordens de magnitude maior do que as sondas Raman tradicionais, por exemplo, 5-etinil-2'-deoxicitidina (EdU), sem recorrer a abordagens complexas de Raman coerente. O sistema de imagem Raman dinâmica melhorada por azo (DAERI) foi capaz de obter imagens Raman de células vivas com resolução temporal de 3,5 s por quadro e resolução espacial confocal de ~270 nm usando uma densidade de potência baixa de 75 μW/μm². Capacitados por esse desempenho, demonstramos DAERI da dinâmica lisossomal e mitocondrial dentro de células vivas. Em particular, a preservação da informação de espectro completo do DAERI utilizou a marca registrada dos sinais Raman espontâneos na região de impressão digital e nos permitiu separar facilmente e com precisão imagens celulares triplo-marcadas ao resolver organelas individuais claramente em uma única varredura de imagem.