Definindo a assinatura EM de transfecções celulares bem-sucedidas

Neste relatório, descrevemos a arquitetura dos reagentes de transfecção Lipofectamine 2000 e 3000, conforme aparecem dentro das células transfectadas, utilizando microscopia eletrônica de transmissão (EM) clássica. Também demonstramos que eles provocam mudanças estruturais consistentes após entrarem nas células, mudanças que não apenas fornecem novas percepções sobre o mecanismo de ação desses reagentes de transfecção em particular, mas também oferecem um método conveniente e robusto para identificar por EM quais células em qualquer cultura foram efetivamente transfectadas. Isso também fornece pistas sobre o(s) mecanismo(s) de seus efeitos tóxicos, quando são aplicados em excesso. Demonstramos que, após serem endocitados em massa pelas células, os esferoides catiônicos de Lipofectamine permanecem intactos durante todo o tempo de cultivo, mas escapam de seus endossomos e penetraram diretamente no citoplasma da célula. Ao fazer isso, provocam um recrutamento estereotípico e rearranjo do retículo endoplasmático (RE), e acabam escapando para o citoplasma e formando 'corpos de inclusão' únicos. Uma vez livres no citoplasma, eles também desenvolvem invariavelmente revestimentos densos e uniformes de ribossomos citoplasmáticos em suas superfícies e, finalmente, são cercados por 'lamelas anulares' do RE. No final, esses envoltórios lamelares anulares tornam-se as 'assinaturas' ultraestruturais desses corpos de inclusão e servem para identificar positivamente e de maneira definitiva todas as células que foram efetivamente transfectadas. Importante, essas novas observações de EM definem várias novas e únicas propriedades dessas Lipofectamines clássicas, e permitem que sejam discriminadas de outros reagentes de transfecção lipídicos ou particulados, que constatamos não rompem fisicamente os endossomos ou acabam em corpos de inclusão, e, de fato, não provocam absolutamente nenhuma dessas reações citoplasmáticas 'assinadas'.