Inativação em uma etapa de genes cromossômicos em Escherichia coli K-12 usando produtos de PCR

Desenvolvemos um método simples e altamente eficiente para interromper genes cromossômicos em Escherichia coli no qual os primers de PCR fornecem a homologia para o(s) gene(s) alvo. Neste procedimento, a recombinação requer a recombinase λ Red do fago, que é sintetizada sob o controle de um promotor indutível em um plasmídeo de número de cópia baixa e facilmente curável. Para demonstrar a utilidade desta abordagem, geramos produtos de PCR usando primers com extensões de 36 a 50 nt que são homólogos às regiões adjacentes ao gene a ser inativado e plasmídeos modelo que carregam genes de resistência a antibióticos flanqueados por locais de reconhecimento FLP (FRT). Usando os respectivos produtos de PCR, realizamos 13 interrupções diferentes de genes cromossômicos. Os mutantes dos genes ou operons arcB, cyaA, lacZYA, ompR-envZ, phnR, pstB, pstCA, pstS, pstSCAB-phoU, recA e torSTRCAD foram isolados como colônias resistentes a antibióticos após a introdução em bactérias que carregam um plasmídeo de expressão Red de DNA sintético (gerado por PCR). Os genes de resistência foram então eliminados usando um plasmídeo auxiliar que codifica a recombinase FLP, que também é facilmente curável. Este procedimento deve ser amplamente útil, especialmente na análise do genoma de E. coli e outras bactérias, pois pode ser realizado em células do tipo selvagem.