Resumo A quantificação precisa de proteínas recombinantes é essencial para avaliar e comparar a eficiência de expressão e otimizar processos de produção. As proteínas fluorescentes emergiram como ferramentas poderosas para o monitoramento em tempo real da expressão gênica e rastreamento de proteínas. No entanto, os métodos padronizados e validados para sua quantificação, particularmente para a amplamente utilizada proteína fluorescente verde, permanecem limitados. Até o momento, não surgiu um protocolo universalmente adotado. Este estudo apresenta um método de alto rendimento para a quantificação da Proteína Fluorescente Verde Esmeralda (EmGFP) produzida recombinante, com base em medições diretas de fluorescência da suspensão celular enquanto quantifica e integra possíveis efeitos de atenuação do sinal. O fluxo de trabalho utiliza exclusivamente equipamentos laboratoriais padrão, garantindo ampla acessibilidade e fácil implementação. Além disso, é descrita a preparação e quantificação padrão de EmGFP interna. O método foi validado de acordo com as diretrizes da FDA "Procedimentos Analíticos e Validação de Métodos para Medicamentos e Biológicos", abordando os requisitos de linearidade, limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ), precisão, exatidão e taxa de recuperação. A investigação foi conduzida utilizando células Escherichia coli BL21 expressando EmGFP, fluoresceína sódica amplamente disponível como padrão químico, GFP comercial e um padrão EmGFP interno. Uma correlação robusta (ajuste linear, R² 0,96) da concentração de EmGFP e unidades de fluorescência relativa (RFU) foi estabelecida, permitindo quantificação eficaz e em alto rendimento de fluorescência utilizando um fluxo de trabalho padronizado em um formato baseado em microtiter, adequado para aplicação em estudos comparativos entre diferentes construtos de expressão, condições e escalas. Ao permitir a quantificação absoluta de proteínas fluorescentes, este método suporta tanto a otimização em tempo real de bioprocessos quanto aplicações mais amplas em pesquisas de produção de proteínas.
Peternell et al. (Quarta-feira,) estudaram essa questão.