Die Plasmamembran ist eine dynamische und komplexe Struktur, die für zahlreiche zelluläre Prozesse wie Signalübertragung, Adhäsion und molekularen Transport von entscheidender Bedeutung ist. Diese Funktionen werden hauptsächlich durch Membranproteine vermittelt – sowohl durch ihre wechselseitigen Interaktionen als auch durch ihre Assoziation mit umgebenden Lipiden. Die Untersuchung der Aktivität und der nanoskaligen Organisation von Membranproteinen in lebenden Zellen stellt jedoch nach wie vor eine Herausforderung dar. Auch modernste Bildgebungstechniken können schnelle, dynamische Prozesse in der Membran nur eingeschränkt erfassen. In dieser Arbeit wird „Protein Micropatterning“ – eine Methode, die eine räumlich kontrollierte Immobilisierung von Membranproteinen in lebenden Zellen ermöglicht – in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, um zwei unterschiedliche Fragestellungen zu untersuchen.Zunächst untersuchten wir die nanoskalige Lipidumgebung verschiedener Transmembranproteine. Durch Immobilisierung der Proteine in definierten Dichten in der Plasmamembran lebender Zellen und durch Messung der Mobilitätsreduktion von Lipid-Tracern bestimmten wir ihren hydrodynamischen Radius. In diesem Assay würde eine enge Anlagerung von Lipiden mit verringerter Fluidität als vergrößerter Radius des Proteins nachweisbar sein. Bei drei von vier getesteten Proteinen stimmten die experimentell bestimmten Größen mit den aus der Proteinstruktur berechneten Größen überein, wodurch wir die Existenz einer Schicht immobilisierter Lipide ausschließen konnten. Aus diesen Ergebnissen schlossen wir, dass solche stark assoziierten Lipide kein universelles Organisationsschema der Plasmamembran darstellen.Zweitens entwickelten wir einen Live-Cell-Assay, um die Kinaseaktivität des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors 3 (FGFR3) zu quantifizieren. Fluoreszenzmarkierter FGFR3 wurde innerhalb definierter Muster immobilisiert und angereichert, und seine Aktivierung wurde über die Rekrutierung des nachgeschalteten Signaltransduktors GRB2 (Growth Factor Receptor Bound 2) verfolgt. Mit diesem Assay verglichen wir die Aktivität von Wildtyp-FGFR3 und vier krankheitsassoziierten Mutanten nach Stimulation mit den Liganden FGF1 und FGF2. Alle Mutanten zeigten eine erhöhte basale Aktivität und unterschiedlich starke Reaktionen bei der Zugabe von Liganden. Im Gegensatz zu früheren Studien misst diese Methode die Rezeptoraktivität gezielt an der Plasmamembran.Zusammen zeigen unsere Studien das Potenzial von „Protein Micropatterning“ zur Untersuchung der Funktion und Organisation von Membranproteinen in lebenden Zellen und liefern neue Erkenntnisse über Lipid-Protein-Wechselwirkungen und Rezeptor-Signalwege.
Veronika Brumovska (Sun,) studied this question.