Engenharia do Genoma do Bacteriófago T4 Usando CRISPR-Cas9

Os bacteriófagos provavelmente constituem a maior biomassa da Terra. No entanto, muito poucos genomas de fagos foram bem caracterizados, sendo o genoma do fago T4 um deles. Mesmo no T4, grande parte do genoma permaneceu não caracterizada. As estratégias genéticas clássicas são tediosas, agravadas por modificações no genoma, como hidroxilmetilação de citosina e glicosilação, que tornam o DNA do T4 resistente à maioria das endonucleases de restrição. Aqui, usando o sistema CRISPR-Cas9 do tipo II, relatamos a edição de genomas T4 tanto modificados (ghm-Citosina) quanto não modificados (Citosina). No entanto, o genoma modificado é menos suscetível ao ataque da nucleasse Cas9 quando comparado ao genoma não modificado. A eficiência da restrição da infecção do fago modificado variou muito de forma dependente do espaçador, o que explica alguns dos resultados contraditórios anteriores. Desenvolvemos uma estratégia de edição do genoma codificadamente entregando em E. coli um plasmídeo CRISPR-Cas9 e um plasmídeo doador contendo a(s) mutação(ões) desejada(s). Mutações pontuais simples e múltiplas, inserções e deleções foram introduzidas em ambos os genomas modificados e não modificados. Braços homólogos flanqueadores de 50 bp foram suficiente para gerar recombinantes que podem ser selecionados sob a pressão da nucleasse CRISPR-Cas9. Uma deleção de 294 bp no gene da RNA ligase rnlB produziu placas viáveis, demonstrando a utilidade dessa estratégia de edição para determinar a essencialidade de um determinado gene. Esses resultados fornecem a primeira demonstração de edição do genoma do fago T4 que pode ser estendida a outros genomas de fagos na natureza para criar recombinantes úteis para aplicações em terapia com fagos.