Origens da estereosseletividade em cetoreductases evoluídas

Mutantes da desidrogenase de álcool de cadeia curta de Lactobacillus kefir, utilizados aqui como cetoreductases (KREDs), reduzem enantiosseletivamente os substratos farmacologicamente relevantes 3-tiaciclopentanona e 3-oxaciciclopentanona. Esses substratos diferem apenas pelo heteroátomo (S ou O) no anel, mas os mutantes de KRED os reduzem com diferentes enantiosseletividades. Estudos cinéticos mostram que essas enzimas são mais eficientes com 3-tiaciclopentanona do que com 3-oxaciciclopentanona. Estruturas cristalinas de raios X de mutantes selecionados ligados a apo e NADP(+) mostram que as preferências conformacionais do laço de ligação do substrato são modificadas por essas mutações. Cálculos mecânicos quânticos e simulações de dinâmica molecular (MD) são usados para investigar o mecanismo de redução pela enzima. Desenvolvemos um método baseado em MD para estudar os complexos do estado de transição diastereomérico e racionalizar diferentes razões enantioméricas. Este método, que investiga a estabilidade da disposição catalítica dentro do teoenzima, mostra uma correlação entre as frações relativas das poses cataliticamente competentes para as reduções enantioméricas e a razão enantiomérica experimental. Algumas mutações, como A94F e Y190F, induzem mudanças conformacionais no sítio ativo que ampliam a pequena bolsa de ligação, facilitando a acomodação do maior átomo de S nesta região e aumentando a seleção por S com 3-tiaciclopentanona. Em contraste, no mutante E145S e na variante final evoluída para a produção em larga escala do intermediário para o antibiótico sulopenem, a seletividade por R é promovida pela redução da pequena bolsa de ligação, desestabilizando assim a orientação pro-S.