Detecção de Staphylococcus aureus pela amplificação do gene nuc por reação em cadeia da polimerase

Primeres de oligonucleotídeos sintéticos de 21 e 24 bases, respectivamente, foram usados na reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar uma sequência do gene nuc, que codifica a nuclease termoestável de Staphylococcus aureus. Um fragmento de DNA de aproximadamente 270 pb foi amplificado a partir de células de S. aureus lisadas ou DNA isolado. O produto da PCR foi detectado por eletroforese em gel de agarose ou análise de Southern blot utilizando uma sonda de hibridação interna do gene nuc de 33-mer. Com células de S. aureus, o limite inferior de detecção foi menor que 10 UFC, e com o alvo isolado o limite inferior de detecção foi de 0,69 pg de DNA. Os primers reconheceram 90 de 90 cepas de referência ou clínicas de S. aureus. A amplificação não foi registrada quando 80 cepas representando 16 outras espécies de estafilococos foram testadas ou quando 20 cepas representando 9 diferentes espécies não estafilocócicas foram testadas. Alguns dos estafilococos não-S. aureus produziram nucleases termoestáveis, mas foram negativos para a PCR. O produto da PCR foi gerado quando S. aureus cultivado in vitro foi usado para preparar espécimes clínicos simulados de sangue, urina, líquido cefalorraquidiano ou líquido sinovial. Nenhum produto de PCR foi gerado quando os fluidos corporais estéreis foram testados. No entanto, a sensibilidade da PCR foi reduzida quando S. aureus no sangue ou urina foi testado em comparação com quando as bactérias em solução salina foram testadas. Com as bactérias no sangue, o limite de detecção da PCR foi de 10(3) UFC. Um resultado positivo de PCR foi registrado quando um número limitado de amostras clínicas de feridas verificadas como infectadas por S. aureus foi testado, enquanto o produto da PCR não foi detectado em materiais de infecções causadas por outras bactérias. A geração de produtos de PCR não foi afetada pela exposição de S. aureus a agentes bactericidas, incluindo cloxacilina e gentamicina, antes do teste, mas foi afetada pela exposição à radiação UV. A PCR para amplificação do gene nuc tem potencial para o diagnóstico rápido de infecções por S. aureus por meio de teste direto de espécimes clínicos, incluindo espécimes de pacientes em terapia antimicrobiana em andamento.