Um Dilema de PCR Quantitativa de Viabilidade: Amplicons Mais Longos São Melhores?

O desenvolvimento da PCR quantitativa de viabilidade (v-qPCR) permitiu uma avaliação mais precisa da viabilidade de uma amostra microbiana, limitando a amplificação de DNA de células mortas. Embora valiosa, a v-qPCR não é infalível. Um dos fatores mais limitantes para uma distinção precisa entre vivo/morto é o comprimento do amplicon de qPCR utilizado. No entanto, não existem consenso ou diretrizes para selecionar e projetar comprimentos de amplicon para resultados ótimos. Neste estudo, foi utilizado uma ampla gama de comprimentos de amplicon que aumentavam incrementalmente (68 a 906 pares de bases) em células vivas e mortas de nove espécies bacterianas tratadas com um corante de viabilidade (monoazida de propídio). O aumento do comprimento do amplicon até aproximadamente 200 pb resultou em diferenças crescentes no ciclo de quantificação (Cq) entre células vivas e mortas, mantendo uma boa eficiência de qPCR. Comprimentos maiores de amplicon, até aproximadamente 400 pb, aumentaram ainda mais a diferença de Cq, mas à custa da eficiência de qPCR. Acima de 400 pb, nenhuma aumento valioso nas diferenças de Cq foi observado. IMPORTÂNCIA A PCR quantitativa de viabilidade (v-qPCR) evoluiu para uma técnica valiosa e convencional para determinar o número de microrganismos viáveis em amostras por qPCR. O comprimento do amplicon é conhecido por ser positivamente correlacionado com a capacidade de distinguir entre bactérias vivas e mortas, mas é negativamente correlacionado com a eficiência de qPCR. Essa relação muitas vezes não é levado em consideração e pode impactar na precisão dos dados de v-qPCR. Atualmente, não há consenso sobre o comprimento ótimo do amplicon. Este artigo fornece métodos para determinar o comprimento ideal do amplicon e sugere uma faixa de comprimento de amplicon para v-qPCR ótima, levando em consideração a troca entre eficiência de qPCR e distinção vivo/morto.