Evolução dos Sítios de Ligação Alostéricos da Fosfofrutocinase de Mamíferos

A fosfofrutocinase (PFK) de mamíferos evoluiu por um processo de duplicação e fusão gênica em tandem, resultando em uma proteína que é mais que o dobro do tamanho das PFKs procarióticas. Com base na conservação completa dos resíduos do sítio ativo na metade N-terminal da enzima eucariótica com aqueles das PFKs bacterianas, assume-se que o sítio ativo da PFK eucariótica está localizado na metade N-terminal. Novamente utilizando comparações de sequência, os quatro sítios de ligantes alostéricos da PFK de mamíferos foram considerados como resultantes dos sítios catalíticos e regulatórios duplicados da PFK ancestral. Estudos anteriores de mutagênese dirigida a sítios Li et al. (1999) Biochemistry 38, 16407-16412; Chang e Kemp (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 670-675 identificaram as origens dos sítios de citrato e frutose 2,6-bisfosfato. Aqui, a mutagênese dirigida a sítios de dois resíduos de arginina (Arg-433 e Arg-429) da fosfofrutocinase de camundongo é utilizada para identificar o sítio inibitório de ATP e, por inferência, o sítio de AMP/ADP. A mutação dos resíduos para alanina reduziu a inibição de ATP no caso de Arg-429 e eliminou a inibição de ATP no caso de Arg-433. O mutante Arg-433 pôde ser inibido por citrato, e essa inibição pôde ser revertida por frutose 2,6-bisfosfato e AMP cíclico, um ligante de alta afinidade para o sítio de ligação de AMP/ADP. Conclui-se que os dois inibidores, ATP e citrato, da PFK de mamíferos interagem com sítios que evoluíram a partir do sítio alostérico de fosfoenolpiruvato/ADP duplicado da PFK ancestral. Os dois sítios para ativadores, frutose 2,6-bisfosfato e AMP ou ADP, evoluíram a partir do sítio catalítico do precursor ancestral.