PCR dependente de RNase H (rhPCR): especificidade melhorada e detecção de polimorfismos de nucleotídeo único utilizando primers bloqueados e cliváveis

FUNDAMENTO: A reação em cadeia da polimerase (PCR) é comumente utilizada para detectar a presença de sequências de ácidos nucleicos tanto em pesquisas quanto em diagnósticos. Embora alta especificidade seja frequentemente alcançada, necessidades biológicas às vezes exigem que os primers sejam colocados em locais subotimizados, o que leva a problemas com a formação de dímeros de primers e/ou má amplificação de sequências homólogas. RESULTADOS: RNase H2 de Pyrococcus abyssi (P.a.) foi utilizada para permitir que a PCR fosse realizada usando primers bloqueados contendo um único resíduo de ribonucleotídeo que são ativados via clivagem pela enzima (rhPCR). A clivagem ocorre 5'-da base de RNA após a hibridação do primer ao DNA alvo. A exigência de que o primer primeiro hibridize com a sequência alvo para ganhar atividade elimina a formação de dímeros de primers e reduz consideravelmente a má amplificação de sequências estreitamente relacionadas. Mismatches próximos à ligação clivável diminuem a eficiência da clivagem pela RNase H2, aumentando ainda mais a especificidade do ensaio. Quando aplicado à detecção de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), descobriu-se que o rhPCR era muito mais sensível do que o PCR padrão específico para alelos. Em geral, a melhor discriminação ocorre quando o mismatch é colocado na base RNA:DNA. CONCLUSÃO: O rhPCR elimina a formação de dímeros de primers e melhora acentuadamente a especificidade da PCR em relação à amplificação indesejada. Essas vantagens do ensaio devem ter utilidade em aplicações desafiadoras de qPCR, como genotipagem, ensaios multiplex em alto nível e detecção de alelos raros.