Um Conjunto de Ferramentas e Pipeline Robusto para a Geração de Genes Repórteres Baseados em Fosmídeo em C. elegans

A engenharia de proteínas fluorescentes em grandes clones genômicos, contidos em BACs ou vetores de fosmídeo, é uma ferramenta para visualizar e estudar padrões espaciais e temporais da expressão gênica em animais transgênicos. Como esses repórteres cobrem grandes regiões genômicas, é provável que capturem todas as informações cis-regulatórias e, portanto, podem ser esperados para recapitular todos os aspectos da expressão gênica endógena. A inserção de tags no lócus do gene alvo contido em clones genômicos por recombinação homóloga (''recombineering'') representa o método mais direto para gerar esses repórteres. Neste artigo metodológico, descrevemos um pipeline simples e robusto para recombinação de fosmídeos, que aplicamos para gerar construções repórteres no nematoide C. elegans, cujo genoma está quase completamente coberto por uma biblioteca disponível de fosmídeos. Geramos um conjunto de ferramentas que permite a inserção de proteínas fluorescentes (GFP, YFP, CFP, VENUS, mCherry) e tags de afinidade em locais-alvo específicos dentro de clones de fosmídeo de maneira praticamente contínua. Nosso novo pipeline é menos complexo e, em nossas mãos, funciona de forma mais robusta do que as estratégias de recombinação descritas anteriormente para gerar fusões repórteres para estudos de expressão de C. elegans. Além disso, nosso conjunto de ferramentas fornece um novo cassete de recombinação que insere uma região intercistrônica spliced SL2 entre o gene de interesse e a proteína fluorescente, criando assim um repórter controlado por todos os elementos regulatórios cis-atuantes 5' e 3' do gene examinado, sem a fusão translacional direta entre os dois. Com essa configuração, o início da expressão e a especificidade tecidual de produtos gênicos secretos, compartimentalizados subcelularmente ou de curta duração podem ser facilmente detectados. Também descrevemos outras aplicações da recombinação de fosmídeos. A simplicidade, velocidade e robustez do pipeline de recombinação descrito aqui devem impulsionar o uso rotineiro dessa estratégia para estudos de expressão em C. elegans.