Desafios do uso de PCR digital em gotículas para amostras ambientais

A reação em cadeia da polimerase digital em gotículas (ddPCR) é um método utilizado para detectar e quantificar ácidos nucleicos, mesmo quando presentes em números excepcionalmente baixos. Embora tenha se mostrado valiosa para estudos clínicos, não foi amplamente adotada para estudos ambientais; no entanto, apesar de algumas limitações, o ddPCR pode representar uma opção melhor do que o qPCR clássico para amostras ambientais. Devido à complexidade da composição química e biológica das amostras ambientais, protocolos voltados para estudos clínicos não são apropriados e os resultados são difíceis de interpretar. Utilizamos amostras de DNA ambiental originárias de estudos de campo para determinar um protocolo para amostras ambientais. As amostras incluíram solos de campo que foram inoculados com o fungo do solo Rhizophagus irregularis (controle positivo ambiental), solos de campo que não foram inoculados e o fungo alvo não estava presente naturalmente (controle negativo ambiental), e amostras de raízes de ambas as categorias de campo. Para controlar o efeito de inibidores do solo, também incluímos amostras de DNA de um controle orgânico extraído de esporos fúngicos puros (controle positivo orgânico). Finalmente, incluímos um controle sem template consistindo apenas dos reagentes da reação de PCR e água livre de nuclease em vez de DNA template. Usando dados originais, examinamos quais fatores contribuem para a baixa resolução em amostras de raízes e solo e propomos melhores práticas para garantir precisão e repetibilidade. Além disso, avaliamos métodos de determinação de limiar manuais e automáticos e propomos um protocolo inovador baseado em múltiplos controles que é mais apropriado para amostras ambientais.