Geração de uma proteína repórter dual-funcional para monitorar a fusão de membranas usando GFP fracionada que se autoassocia

Proteínas repórteres fracionadas capazes de autoassociação e reativação têm aplicações na pesquisa biomédica, mas o design dessas proteínas, especialmente a seleção de pontos de divisão apropriados, tem sido um tanto arbitrário. Descrevemos uma nova metodologia para facilitar a geração de proteínas fracionadas usando GFP fracionada como um módulo de autoassociação. Primeiro, inserimos todo o módulo GFP em um dos vários pontos de divisão candidatos na proteína de interesse e escolhemos clones que mantiveram o sinal GFP e alta atividade em relação à proteína original. Depois que esses clones quiméricos foram identificados, um par final de proteínas fracionadas foi gerado dividindo a quimera inserida com GFP dentro do domínio GFP. Aplicando essa estratégia à luciferase Renilla reniformis, identificamos um novo ponto de divisão que apresentou 10 vezes mais atividade do que o ponto de divisão anterior. O processo de fusão de membranas foi monitorado com alta sensibilidade usando um novo par de proteínas repórteres fracionadas. Também identificamos com sucesso novos pontos de divisão para a proteína HaloTag e luciferase de vaga-lume, gerando pares de proteínas fracionadas que se autoassociam e que recuperaram as funções tanto da GFP quanto da proteína original. Este método simples de triagem facilitará o design de proteínas fracionadas que são capazes de autoassociação por meio dos domínios de GFP fracionada.