Um ensaio SNaPshot multiplex é um método rápido e econômico para detectar mutações do domínio exonuclease da POLE no carcinoma endometrial

Determinar o status de mutação da polimerase de DNA replicativa epsilon (POLE) em carcinomas endometriais (ECs) tem importantes implicações clínicas, dado que a maioria dos tumores "ultramutados" que apresentam mutações patogênicas no domínio exonuclease da POLE (mut POLE) têm um prognóstico favorável, mesmo entre os histótipos de alto grau. Atualmente, não existem características morfológicas ou imuno-fenotípicas específicas que permitam a detecção precisa de tumores mutantes de POLE sem testes moleculares. Consequentemente, identificar tumores mutantes de POLE tem sido desafiador sem recorrer a abordagens de sequenciamento de DNA que são dispendiosas e/ou demoradas. Aqui, desenvolvemos um novo ensaio SNaPshot para facilitar a triagem rotineira e eficiente de mutações de POLE em EC. O ensaio SNaPshot investiga 15 locais nucleotídicos dentro dos éxons 9, 11, 13 e 14 que codificam o domínio exonuclease da POLE. Os locais variantes foram selecionados com base na recorrência, evidências de impacto funcional, associação com alta carga mutacional tumoral e/ou detecção em estudos de desfechos clínicos de EC. Com base nas variantes somáticas patogênicas relatadas na literatura, prevê-se que o ensaio tenha uma sensibilidade clínica de 90% a 95% para ECs. Estudos de validação mostraram 100% de especificidade e sensibilidade para as variantes cobertas, com resultados genotípicos esperados tanto para os controles positivos (n=11) quanto negativos (n=20) em múltiplos testes repetidos e séries de diluição. A sensibilidade analítica foi conservadoramente aproximada em uma fração alélica variante (VAF) de 10%, com detecção documentada tão baixa quanto 5% de VAF. Como esperado, o ensaio SNaPshot demonstrou maior sensibilidade do que o sequenciamento Sanger para VAFs inferiores a 20%, uma característica importante para a detecção de mutações somáticas. Aqui, desenvolvemos e validamos o primeiro ensaio SNaPshot para detectar mutações hotspots de POLE. Embora abordagens baseadas em sequenciamento de nova geração e sequenciamento Sanger também tenham sido utilizadas para detectar mutações de POLE, a abordagem SNaPshot oferece um balanço útil de sensibilidade analítica, custo-efetividade e eficiência em uma configuração de alta carga de casos.