Efeito das deleções de laço na ligação e transporte de enterobactina férrica pelo FepA

O sideróforo enterobactina férrica entra na Escherichia coli através do porífero da membrana externa (OM) FepA, que contém um canal aquoso transmembranar que normalmente é ocluído por outras partes da proteína. Após a ligação do sideróforo em um local dentro dos laços de superfície, o FepA sofre mudanças conformacionais que promovem a internalização do ligante. Avaliamos a participação de diferentes laços no reconhecimento e captação do ligante criando e analisando uma série de deleções. Engenheiramos geneticamente 26 mutações que removeram de 9 a 75 aminoácidos de nove laços e duas regiões enterradas da proteína OM. As mutações tiveram vários efeitos na reação de captação, que discernimos ao comparar as concentrações de substrato de ligação semi-maximal (Kd) e captação (Km): cada deleção de laço afetou a cinética do transporte do sideróforo, diminuindo ou eliminando a afinidade de ligação e a eficiência de transporte. Classificamos as mutações em três grupos com base na sua leve, forte ou completa inibição da taxa de transporte de enterobactina férrica através da OM. Finalmente, a caracterização dos mutantes de FepA revelou que experimentos anteriores subestimaram a afinidade do FepA pela enterobactina férrica: a interação entre a proteína e o sideróforo férrico é tão intensa (Kd < 0,2 nM) que o FepA tolerou as grandes reduções na afinidade que algumas deleções de laço causaram, sem perda da funcionalidade de captação. Ou seja, como outros poríferos, muitos dos laços do FepA são superficialmente dispensáveis: o transporte de enterobactina férrica ocorreu sem eles, em níveis que permitiram o crescimento bacteriano.