Método rápido para separação de DNA bacteriano de substâncias húmicas em sedimentos para reação em cadeia da polimerase

A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi usada para amplificar um fragmento do gene ribossomal 16S de Escherichia coli a partir de sedimentos com altos conteúdos de substâncias húmicas. O DNA total foi extraído de 1 g de amostras semeadas ou não semeadas de E. coli por um método rápido de congelamento e descongelamento. Várias abordagens (uso de colunas de Bio-Gel P-6 e P-30 e Sephadex G-50 e G-200, bem como o uso do fragmento de Stoffel) foram utilizadas para reduzir a interferência na PCR. Os melhores resultados foram obtidos quando extratos de DNA bruto contendo substâncias húmicas foram purificados usando colunas giratórias de Sephadex G-200 saturadas com buffer Tris-EDTA (pH 8.0). Frações eluídas foram coletadas para análises de PCR. O fragmento de DNA amplificado foi obtido de sedimentos semeados contendo menos de 70 células de E. coli por g. Como apenas 1/100 das frações eluídas contendo extratos de DNA de 70 células por g foi utilizada para a PCR, a sensibilidade de detecção foi determinada em menos de 1 célula de E. coli. Assim, a extração direta de DNA acoplada a esta técnica para remover interferência por substâncias húmicas e seguida pela PCR pode ser uma ferramenta poderosa para detectar baixos números de células bacterianas em amostras ambientais contendo substâncias húmicas.