Explorando o viés de protocolo em estudos do microbioma das vias aéreas: um versus dois passos de PCR e região do gene 16S rRNA V3 V4 versus V4

ANTECEDENTES: Estudos sobre o microbioma das vias aéreas foram realizados utilizando uma ampla gama de protocolos de laboratório para sequenciamento de alto rendimento do gene 16S ribossomal de RNA (16S rRNA). Buscamos determinar o impacto do número de etapas da reação em cadeia da polimerase (PCR) (1 ou 2 etapas) e da escolha da região do gene marcador alvo (V3 V4 e V4) na apresentação do microbioma das vias aéreas superiores e inferiores. Nossas análises incluíram sequenciamento pelo Illumina MiSeq seguindo três configurações: Configuração 1 (PCR de 2 etapas; região V3 V4), Configuração 2 (PCR de 2 etapas; região V4), Configuração 3 (PCR de 1 etapa; região V4). As amostras incluíram lavagem bucal, escovas de espécimes protegidas e lavagem broncoalveolar protegida (saudável e doença pulmonar obstrutiva), além de controles negativos. RESULTADOS: O número de sequências e variantes de sequência de amplicon (ASV) diminuiu na ordem configuração1 > configuração2 > configuração3. Essa tendência parecia estar associada a uma resolução taxonômica aumentada ao sequenciar a região V3 V4 (configuração 1) e a um número aumentado de pequenas ASVs nas configurações 1 e 2. Esta última foi considerada um resultado de contaminação nos protocolos de PCR de duas etapas, bem como o sequenciamento em múltiplas execuções (configuração 1). Embora os gêneros Streptococcus, Prevotella, Veillonella e Rothia predominassem, diferenças na abundância relativa foram observadas em todas as configurações. As análises de beta-diversidade revelaram que, enquanto as amostras de lavagem bucal (alta biomassa) se agruparam independentemente do número de etapas de PCR, as amostras dos pulmões (baixa biomassa) se separaram. A remoção de contaminantes identificados utilizando o pacote Decontam no R não resolveu as diferenças nos resultados entre as configurações de sequenciamento. CONCLUSÕES: Diferenças no número de etapas de PCR terão um impacto nas descrições finais da comunidade bacteriana, e mais ainda para amostras de baixa carga bacteriana. Nossas descobertas não puderam ser explicadas apenas por diferenças nos níveis de contaminação, sendo mais pesquisas necessárias para entender como as variações nos protocolos de PCR e reagentes podem estar contribuindo para o viés de protocolo observado.