Desenvolvimento de um ensaio robusto de avaliação da qualidade e quantidade de DNA por qPCR para preparação de biblioteca de sequenciamento de próxima geração direcionado

O sequenciamento de próxima geração (NGS) está se tornando um padrão para análises genéticas de amostras clínicas. Os DNAs recuperados de espécimes de tecido fixados em formol e embebidos em parácterina (FFPE) estão comumente degradados, e espécimes como biópsias de núcleo às vezes são muito pequenos para obter DNA suficiente para aplicações de NGS. Portanto, é importante medir com precisão tanto a quantidade quanto a qualidade do DNA a partir de amostras clínicas. No entanto, não existe um método padrão para análises de quantidade e qualidade do DNA para preparação de biblioteca de NGS. Testamos quatro métodos diferentes (PicoGreen, fluorometria Qubit®, ensaio qPCR baseado em TaqMan e SYBR-Green) e comparamos cada um com o controle de referência RNase P TaqMan. Descobrimos que o ensaio qPCR baseado em SYBR-Green fornece uma quantificação de DNA consistente e precisa, mantendo seu custo relativamente baixo e a alta produtividade. Projetamos um ensaio qPCR de dupla sonda SYBR-Green para avaliação de quantidade e qualidade de DNA para a preparação de biblioteca de NGS direcionada. Este ensaio fornece um Dscore (pontuação de degradação) do DNA interrogado ao analisar dois tamanhos diferentes de amplicons. Mostramos um exemplo de uma amostra clínica com um Dscore muito alto (alta degradação). Com uma quantificação regular de DNA, sem considerar o estado de degradação, não foram obtidas bibliotecas de NGS corretas. No entanto, após otimizar a condição da biblioteca considerando sua pobre qualidade de DNA, uma biblioteca razoavelmente boa e resultados de sequenciamento foram obtidos. Em resumo, desenvolvemos e apresentamos um novo ensaio de análise de quantidade e qualidade de DNA por qPCR para a preparação de biblioteca de NGS direcionada. Este ensaio pode ser mais eficiente para amostras clínicas com alta degradação e baixa qualidade de DNA.