A função de espalhamento de ponto de um microscópio confocal: sua medição e uso na deconvolução de dados 3-D

RESUMO Medimos a função de espalhamento de ponto (PSF) para um microscópio de varredura a laser confocal MRC-500 usando esferas fluorescentes sub-resolução. As PSFs foram medidas para duas lentes de alta abertura numérica—o Zeiss plan-neofluar 63 × imersão em água e o Leitz plan-apo 63 × imersão em óleo—em três tamanhos diferentes da abertura do detector confocal. As PSFs medidas são bastante simétricas, tanto radial quanto axialmente. Em particular, há consideravelmente menos assimetria axial do que foi demonstrado em medições de PSFs convencionais (não confocais). As medições da largura do pico na metade da altura máxima do pico para a abertura mínima do detector deram aproximadamente 0,23 e 0,8 μm para a resolução radial e axial, respectivamente (4,6 e 15,9 em unidades ópticas adimensionais). Isso aumentou para 0,38 e 1,5 μm (7,5 e 29,8 em unidades adimensionais) para a maior abertura do detector examinada. As funções de transferência óptica resultantes (OTFs) foram utilizadas em um procedimento de deconvolução iterativa e restrita para processar conjuntos de dados confocais tridimensionais de um espécime biológico—células de raiz de ervilha rotuladas in situ com um sondas fluorescentes para genes ribossomais. A deconvolução melhorou significativamente a clareza e o contraste dos dados. Além disso, a perda na resolução produzida pelo aumento do tamanho da abertura do detector poderia ser restaurada pelo procedimento de deconvolução. Portanto, para muitos espécimes biológicos que são apenas fracamente fluorescentes pode ser preferível abrir a abertura do detector para aumentar a intensidade do sinal detectado, e assim a relação sinal-ruído, e, em seguida, restaurar a resolução por deconvolução.