A Purificação e Mecanismo de Ação do Cofator Antitrombina-Heparina Humana

Apresenta-se um procedimento para purificar o cofator antitrombina-heparina do plasma humano. O produto final é homogêneo, conforme avaliação por eletroforese em gel de disco, eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e imuno-eletroforese. O rendimento final médio é de 12%. Um anticorpo específico dirigido contra preparações de inibidor puro precipita virtualmente toda a atividade de antitrombina e cofator de heparina do plasma defibrinado. A purificação, a imunoprecipitação e outros dados indicam que ambas as atividades são propriedades de uma única espécie molecular. O inibidor e a trombina formam um complexo estequiométrico 1:1, que não pode ser dissociado com produtos químicos desnaturantes e redutores. A adição de heparina, um anticoagulante amplamente utilizado que acelera especificamente a ação do nosso inibidor, aumenta a taxa de formação desse complexo sem alterar sua estequiometria ou sua dissociabilidade. A interação da trombina com o cofator antitrombina-heparina requer a presença do centro ativo de serina da enzima e resíduos de arginina no inibidor, uma vez que a modificação química de qualquer um desses resíduos críticos inibe a formação do complexo tanto na presença quanto na ausência de heparina. Sugerimos que, de maneira análoga aos sistemas de tripsina-inibidor de tripsina, ocorre uma interação específica entre o centro ativo de serina da trombina e um local reativo único de arginina-x no cofator antitrombina-heparina. Além disso, os resíduos de lisina do inibidor provavelmente servem como um local de ligação para a heparina, uma vez que a modificação química desses resíduos praticamente elimina a atividade do cofator de heparina, com apenas uma redução mínima da atividade da antitrombina. Postulamos que a heparina se liga ao inibidor e causa uma mudança conformacional que resulta em uma exposição mais favorável do local reativo de arginina, permitindo uma interação rápida com a trombina.