A Persistência Metabólica Dependente de Glicerol de Pseudomonas putida KT2440 Reflete a Lógica Regulatória do Repressor GlpR

UNLABELLED: O crescimento da bactéria do solo Pseudomonas putida KT2440 em glicerol como a única fonte de carbono é caracterizado por uma fase de atraso prolongada, não observada com outros substratos de carbono. Nós examinamos o crescimento bacteriano em culturas de glicerol enquanto monitorávamos a atividade metabólica de células individuais. A microscopia de fluorescência e a citometria de fluxo, bem como a análise do início temporal do crescimento em culturas de células singulares, revelaram que a adoção de um regime de metabolismo de glicerol não foi resultado de uma mudança gradual na população inteira, mas refletiu um switch bimodal dependente do tempo entre bactérias metabolicamente inativas (ou seja, não crescendo) e totalmente ativas (ou seja, crescendo). Uma fusão transcricional Φ(glpD-gfp) (um proxy da atividade da glicerol-3-fosfato G3P desidrogenase) vinculou o fenótipo macroscópico à expressão dos genes glp. Tanto a deleção de glpR (codificando o repressor transcricional responsivo a G3P que controla a expressão do gene do agrupamento glpFKRD) quanto a alteração da formação de G3P (por superexpressão de glpK, codificando a glicerol quinase) aboliram a expressão bimodal de glpD. Essas manipulações eliminaram o início de crescimento estocástico ao encurtar a fase de atraso longa. A provisão de glpR em trans restaurou os fenótipos perdidos no mutante ΔglpR. Assim, o regime prolongado de não crescimento de P. putida em glicerol pode ser rastreado até o dispositivo regulatório que controla a transcrição dos genes glp. Como o agonista fisiológico do GlpR é G3P, a disposição dos componentes metabólicos e regulatórios neste ponto de controle mescla um loop de feedback positivo com uma resposta transcricional não linear, uma estrutura que promove a mudança dependente do tempo observada entre dois estados fisiológicos alternativos. IMPORTÂNCIA: A variação fenotípica é um atributo generalizado de procariotos que leva, entre outras coisas, ao surgimento de bactérias persistentes, ou seja, membros vivos, mas não em crescimento, dentro de uma população clonal geneticamente. A persistência permite que uma fração das células evite a morte causada por condições ou agentes que destroem a maioria das bactérias em crescimento (por exemplo, alguns antibióticos). Os mecanismos moleculares conhecidos que fundamentam o fenômeno incluem mudanças genéticas, variações epigenéticas e multistabilidade baseada em feedback. Mostramos que um estado prolongado de não crescimento da população bacteriana pode ser causado por uma arquitetura regulatória distinta de genes metabólicos quando as células enfrentam nutrientes específicos (por exemplo, glicerol). Pseudomonas putida pode ter adotado a hedging metabólica dependente da fonte de carbono resultante como uma característica vantajosa para explorar novos cenários químicos e nutricionais. Derrotar tais características adaptativas que ocorrem naturalmente em bactérias ambientais é fundamental para melhorar o desempenho desses microrganismos como catalisadores de células inteiras em um arranjo de biorreator.