Transporte in vitro de uma proteína nuclear fluorescente e exclusão de proteínas não nucleares.

Um sistema in vitro foi desenvolvido que fornece um ensaio microscópico rápido para transporte nuclear. O ensaio utiliza um extrato de ovos de Xenopus, núcleos normais ou sintéticos e uma proteína nuclear marcada fluorescentemente, nucleoplasmina. Este sistema in vitro imita com precisão o transporte nuclear in vivo, tanto em exclusividade quanto na quantidade de acúmulo observada (até 17 vezes). O acúmulo seletivo de nucleoplasmina fluorescente é observado microscopicamente dentro de 30 minutos com núcleos de fígado de rato, núcleos embrionários de Xenopus, núcleos de esperma de Xenopus regenerados ou núcleos reconstitutos in vitro a partir de DNA de bacteriófago lambda. Este transporte requer o domínio sinal da nucleoplasmina. Além disso, a capacidade dos núcleos de acumular nucleoplasmina correlaciona-se diretamente com sua capacidade de excluir as proteínas não nucleares fluorescentes, FITC-imunoglobulina e ficoeritrina. Um modelo de transporte ativo preveria que o transporte nuclear fosse dependente de temperatura e energia e que a inibição do transporte por baixa temperatura ou depleção de energia seria reversível. Ambas as previsões foram confirmadas em nosso sistema. O acúmulo de nucleoplasmina aumenta com a temperatura, enquanto a proteína é completamente excluída a 0 graus C. Os efeitos da baixa temperatura são reversíveis. Como encontrado para nucleoplasmina marcada com 125I (Newmeyer, D. D., J. M. Lucocq, T. R. Bürglin, e E. M. De Robertis, 1986, EMBO (Eur. Mol. Biol. Organ.) J., 5:501-510), o transporte de nucleoplasmina fluorescente é inibido pela depleção de ATP. Este efeito é revertido pela adição posterior de ATP. Em condições de depleção de ATP, proteínas não nucleares continuam a ser excluídas. Esses resultados defendem um papel direto do ATP no transporte, em vez de um papel simples na preservação da integridade do envelope. Em um primeiro passo para definir os requisitos mínimos para um meio de transporte, extratos de ovos foram depletados de vesículas de membrana. Extratos depletados de membrana não suportam transporte nem mantêm a integridade do envelope nuclear.