Matriz citoesquelética epitelial e matriz nuclear-rede de filamentos intermediários: organização tridimensional e composição proteica.

Células renais caninas de Madin-Darby (MDCK) crescem como colônias epiteliais diferenciadas que apresentam organização semelhante a tecidos. Examinamos os elementos estruturais subjacentes à morfologia da colônia in situ utilizando três extrações consecutivas que produzem frações bem definidas para análises de microscopia e bioquímica. Primeiro, proteínas solúveis e fosfolipídios foram removidos com Triton X-100 em um tampão fisiológico. A estrutura esquelética resultante reteve núcleos, redes densas de filamentos citoplasmáticos, complexos de junção intercelular e estruturas apicais de microvilos. A microscopia eletrônica de varredura mostrou que a morfologia celular apical permanece amplamente inalterada pela extração com detergente. Desmossomos residuais, como podem ser vistos em seções finas, também foram bem preservados. A estrutura esquelética foi visualizada em três dimensões como um montante não embutido que revelou as redes de filamentos que estavam mascaradas em seções finas embutidas em Epon da mesma preparação. A topografia dos filamentos citoesqueléticos foi relativamente constante em toda a folha epitelial, particularmente nas fronteiras intercelulares. Essa organização dos filamentos esqueléticos epiteliais nas fronteiras celulares contíguas contrastou fortemente com a organização mais independente das redes em células autônomas como fibroblastos. Uma extração adicional removeu as proteínas do citoesqueleto sensíveis ao sal e a cromatina como frações separadas, e deixou a matriz nuclear-rede de filamentos intermediários (NM-IF). O NM-IF continha apenas 5% da proteína celular total, mas a microscopia eletrônica de transmissão de montante inteiro e a imunofluorescência mostraram que essa estrutura estava organizada como no epitélio intacto. Imunoblotting demonstrou que vimentina, citoqueratinas, proteínas desmosomais e uma proteína da matriz nuclear de 52.000 daltons foram encontradas quase exclusivamente na estrutura NM-IF. A vimentina estava principalmente perinuclear, enquanto as citoqueratinas estavam localizadas nas bordas celulares. A proteína da matriz nuclear de 52.000 daltons foi confinada à matriz desprovida de cromatina, e as proteínas desmosomais foram observadas em arranjos poligonais pontuais nas junções intercelulares. Os filamentos do NM-IF mostraram-se interconectados, via desmossomos, em toda a colônia epitelial. A morfologia epitelial diferenciada foi refletida tanto na estrutura citoesquelética quanto na estrutura NM-IF.