Construção de uma biblioteca de expressão de cDNA de levedura regulada por GAL1 e sua aplicação na identificação de genes cuja superexpressão causa letalidade na levedura.

Construiu-se uma biblioteca de expressão induzível por galactose clonando cDNAs de levedura unidirecionalmente sob o controle do promotor GAL1 em um vetor de transporte centromérico. Foram feitas onze bibliotecas independentes, cada uma com um tamanho médio de cerca de 1 x 10(6) clones, aproximadamente 50 vezes maior do que a população de mRNA relatada em uma célula de levedura. A partir desta biblioteca, os cDNAs LEU2 e HIS3 foram recuperados com uma frequência de cerca de 1 em 10(4) e em 12 de 13 casos estes foram expressos de maneira dependente de galactose. A análise de sequência dos cDNAs complementares leu2 e his3 indica que eles contêm toda a sequência codificadora e grande parte da região não traduzida 5'. Para testar a utilidade da biblioteca na identificação de genes cuja superexpressão confere um fenótipo específico, triamos 25.000 transformantes de levedura para letalidade em galactose. Entre 15 clones que apresentaram letalidade induzível por galactose estavam cDNAs que codificam proteínas estruturais, incluindo ACT1 (actina), TUB2 (beta-tubulina) e ABP1 (proteína 1 de ligação à actina), e genes em vias de transdução de sinal, incluindo TPK1 (uma quinase dependente de cAMP) e GLC7 (fosfatase proteica tipo 1). cDNAs que superexpressam NHPB (proteína não-histona B) e NSR1 (proteína de reconhecimento de sequência nuclear) também foram encontrados como letais. Dentre estes, ACT1 foi isolado quatro vezes e NSR1 três vezes. As características úteis desta biblioteca para clonagem de cDNA em levedura por complementação e para a identificação de genes cuja superexpressão confere fenótipos específicos são discutidas.