Análise das proteínas transformadoras do adenovírus das regiões iniciais 1A e 1B com antisoros para antígenos de fusão indutíveis produzidos em Escherichia coli

Vetores de plasmídeo foram construídos para expressar três antígenos tumorais do adenovírus fundidos a uma porção da proteína trpE de Escherichia coli. A inserção do DNA do adenovírus tipo 2 da região inicial 1A (E1A) em tal plasmídeo resultou em uma proteína de fusão que continha os 266 aminoácidos C-terminal dos 289 aminoácidos codificados pelo mRNA viral 13S. De maneira semelhante, a inserção do DNA do adenovírus tipo 5 correspondente às proteínas E1B de 55 e 21 quilodaltons levou à produção de proteínas de fusão contendo sequências de aminoácidos dessas proteínas. Após a indução com ácido indoleacrílico, as proteínas de fusão se acumularam de forma estável nas células de E. coli. Usando uma simples extração de proteína insolúvel, foram obtidos de 1 a 10 mg de proteína de fusão por litro de cultura. As proteínas de fusão foram purificadas em géis de poliacrilamida preparativa e usadas para imunizar coelhos. Antisoros específicos para as proteínas E1A de 289 e 243 aminoácidos, e para as proteínas E1B de 55 e 21 quilodaltons foram obtidos. Esses soros foram usados para imunoprecipitar os antígenos tumorais em células infectadas com adenovírus selvagem e vários mutantes ou para analisá-los por um procedimento de imunoblotting. As proteínas E1A mutantes em que os 70 aminoácidos C-terminal foram deletados foram fosforiladas em extensões muito menores do que as proteínas E1A selvagens. Isso indica que a região deletada é importante para o processo de fosforilação. As proteínas E1A foram extraídas, sedimentadas em gradientes de glicerol, analisadas por imunoprecipitação e encontradas principalmente como monômeros.