Construção de um gene cDNA modular da diidrofolato redutase: análise dos sinais utilizados para uma expressão eficiente.

Genes modulares da diidrofolato redutase (DHFR) foram construídos com segmentos contendo o promotor principal tardio do adenovírus, um sítio de splicing 3' de um gene de imunoglobulina de região variável, um cDNA de DHFR e porções do genoma do vírus símio 40 (SV40). A transferência mediada por DNA desses genes transformou células DHFR- de ovário de hamster chinês para o fenótipo DHFR+. Os transformantes continham de uma a várias cópias do DNA transfetado integrado no genoma do hospedeiro. Clones submetidos ao crescimento em concentrações crescentes de metotrexato eventualmente deram origem a linhagens contendo várias centenas de cópias do DNA transformador. A análise do mRNA de DHFR produzido em linhagens amplificadas indicou o seguinte. (i) Todos os clones utilizam o promotor principal tardio do adenovírus para a iniciação da transcrição. (ii) Um íntron híbrido formado pelo sítio de splicing 5' do líder tardio do adenovírus e um sítio de splicing 3' de um gene de imunoglobulina de região variável é devidamente excisado. (iii) O mRNA não é eficientemente poliadenilado em sequências na extremidade 3' do cDNA de DHFR, mas usa sinais de poliadenilação a jusante do cDNA de DHFR. Três clones independentes produzem um mRNA de DHFR contendo sequências do SV40 ou pBR322 e o RNA é poliadenilado no sítio de poliadenilação tardia do SV40. Outro clone recombinou-se no DNA celular e aparentemente usa uma sequência celular para poliadenilação. A introdução de um segmento contendo o sinal de poliadenilação precoce do SV40 na extremidade 3' do gene cDNA de DHFR gerou um recombinante capaz de transformar células para o fenótipo DHFR+ com pelo menos um aumento de 10 vezes na eficiência, demonstrando a necessidade de um sinal de poliadenilação eficiente. A anexação de um segmento de DNA contendo o amplificador de transcrição (repetição de 72 pares de bases) do SV40 aumentou ainda mais a atividade biológica do gene modular de DHFR em 50 a 100 vezes.