Estabilização da creatinase de Pseudomonas putida por mutagênese aleatória

A creatinase (creatina amidinohidrolase, EC 3.5.3.3) de Pseudomonas putida é um homodímero de 45 kDa de massa molecular da subunidade, cuja estrutura tridimensional é conhecida com resolução de 1,9 Å. Três mutantes pontuais, A109V, V355M e V182I, assim como um mutante duplo combinando A109V e V355M, e o mutante triplo com as três substituições, foram comparados com a creatinase do tipo selvagem em relação às suas propriedades físicas e enzimológicas. Dados de cristal de alta resolução para a creatinase do tipo selvagem e os dois primeiros mutantes sugerem isomorfismo pelo menos para essas três proteínas (R. Huber, comm. pessoal). Medições físico-químicas confirmam essa previsão, mostrando que as mutações não têm efeito nem na estrutura quaternária e conformação bruta, nem nas propriedades catalíticas em comparação com a creatinase do tipo selvagem. A substituição de V182 (na extremidade exposta ao solvente da primeira hélice do domínio C-terminal) não causa diferenças significativas em comparação com a enzima do tipo selvagem. As outras mutações pontuais estabilizam o primeiro passo na transição de desnaturação bifásica sem afetar o segundo. Em resumo, a estabilidade aumentada parece refletir leves melhorias no empacotamento local sem criar novas ligações bem definidas. O aumento na hidrofobicidade gerado pela introdução de grupos metila adicionais (A109V, V182I) deve ser compensado por pequenos reajustes na estrutura global. Interações secundárias ou quaternárias não são afetadas. Ao passar de mutantes simples para duplos e triplos, a uma primeira aproximação, os incrementos de estabilização são aditivos.