Mutagênese dirigida por oligonucleotídeos usando vetores derivados de M13: um procedimento eficiente e geral para a produção de mutações pontuais em qualquer fragmento de DNA

Este artigo apresenta um procedimento versátil e eficiente para a construção de mutações específicas no local dirigidas por oligodeoxirribonucleotídeos em fragmentos de DNA clonados em vetores derivados de M13. Como exemplo, a produção de uma mutação de transição em um clone do gene MATa1 da levedura é descrita. O oligonucleotídeo é hibridizado ao DNA molde e moléculas duplamente encadenadas e covalentemente fechadas são geradas pela extensão do primer de oligonucleotídeo com a DNA polimerase de E. coli (fragmento grande) e ligadura com a DNA ligase T4. O DNA circular fechado de dupla cadeia resultante (CC-DNA) é separado de moléculas não ligadas e incompletamente estendidas por centrifugação em gradiente de sacarose alcalina. Esta purificação é essencial para a produção de mutantes com alta eficiência. Células competentes de E. coli JM101 são transformadas com a fração de CC-DNA e o DNA de fita simples é isolado de placas individuais. Os recombinantes são submetidos à triagem por 1) triagem de endonucleases de restrição para a perda do sítio Hinf I na região alvo, e 2) por hibridização em dot blot usando o oligonucleotídeo mutagênico como sonda. O DNA de dupla fita é isolado da sequenciação. A eficiência da produção de mutantes está na faixa de 10-45% e nenhuma medida para prevenir reparo de desajuste é necessária.