Um Sistema de Detecção de Mutação Eficiente: Marcação Fluorescente Multicolorida Pós-PCR e Análise de Polimorfismo Conformacional de Cadeias Simples por Eletrofóreses Capilares

O uso eficaz do conhecimento das sequências do genoma humano em estudos de doenças hereditárias ou câncer depende fortemente de métodos eficientes para a detecção de mutações em amostras individuais. Aqui descrevemos um sistema simples e eficiente de escaneamento de mutações no qual os produtos de PCR são marcados pós-PCR com dois corantes fluorescentes diferentes em um tubo e analisados por um sistema automatizado de eletroforese capilar utilizando condições de polimorfismo de conformação de fita simples (SSCP) (PLACE-SSCP). Com o uso apropriado de um DNA de controle interno, as diferenças nas mobilidades eletrofóreticas entre uma referência e amostras são avaliadas com precisão, e então a presença de mutações é julgada estatisticamente. Trinta e três das 34 mutações conhecidas em fragmentos de três contextos sequenciais não relacionados de até 741 bp foram detectadas utilizando uma condição de eletroforese com um nível de confiança de <0.3% de falso positivo. Todas as mutações foram detectadas analisando-se a duas temperaturas. O sistema descrito tem a vantagem de pouca intervenção humana, curto tempo de análise, alta sensibilidade e objetividade na interpretação dos dados.