Estabelecimento e regulação hormonal de uma linha celular pré-osteocítica transformada condicionalmente a partir de osso humano adulto.

Os osteócitos são formas diferenciadas de osteoblastos que surgem ao serem aprisionados na matriz óssea. Neste relatório, descrevemos o estabelecimento e a regulação hormonal da primeira linha celular pré-osteocítica humana transformada condicionalmente. Células ósseas primárias adultas foram obtidas a partir de digestão enzimática de chips esponjosos. As células foram infectadas com adenovírus-ori-SV40 tsA 209, que codifica um antígeno T grande sensível à temperatura. Após a imortalização, isolamos um clone designado HOB-01-C1. Esta linha celular expressou o antígeno T mutante e proliferou na temperatura permissiva (34 °C), mas parou de se dividir na temperatura não permissiva (39-40 °C). A microscopia eletrônica das células incubadas a 39 °C demonstrou a presença de processos celulares pré-osteocíticos, alguns dos quais pareciam formar junções comunicantes ou eram ricos em microfilamentos. O clone expressou RNA mensageiro (mRNA) de procollágeno tipo 1 (I) e secretou o peptídeo C do procollágeno tipo I em ambas as temperaturas, e essa expressão foi elevada de 1,6 a 1,8 vezes a 40 graus C. As células expressaram níveis basais muito baixos de atividade da fosfatase alcalina (aproximadamente 0,02 nmol/min.mg), que foram aumentados de 2 a 5 vezes de forma dependente da dose por 0,1-100 nM de 1 alfa,25-diidroxivitamina D3 (vitamina D3) em ambas as temperaturas. A vitamina D3 também aumentou a secreção de osteocalcina de forma dependente da dose quando o clone foi mantido a 34 °C (aproximadamente 6 vezes), e essa estimulação foi aumentada em mais de 5 vezes a 40 °C. Em contraste com a baixa expressão da fosfatase alcalina, as células secretaram altas quantidades de osteocalcina em resposta à vitamina D3 (aproximadamente 15 ng/mg de proteína celular); esse perfil bioquímico também se assemelhava ao dos pré-osteócitos. A coloração histoquímica com alizarina vermelho-S demonstrou que essas células rapidamente produziam nódulos mineralizados em ambas as temperaturas. O PTH (10 e 100 nM) não teve efeito na acumulação intracelular de cAMP a 34 °C, mas estimulou um aumento de 14 a 18 vezes na produção desse segundo mensageiro a 40 °C. Em contraste, 100 nM de prostaglandina E2 e 1 microM de forskolina estimularam melhor a síntese de cAMP a 34 °C. A análise de Western blot indicou que as células expressavam CD44, um marcador putativo de osteócitos, em ambas as temperaturas. Finalmente, a interleucina-1 beta e o fator de necrose tumoral-alfa (1-1000 pM) estimularam aumentos dependentes da dose na secreção de interleucina-6 e proteína quimioatratora de monócitos-1 a 34 °C e 40 °C. Concluímos que a linha celular HOB-01-C1 tem um fenótipo pré-osteocítico. Além disso, essas células respondem a hormônios calcitrópicos e citocinas reabsortivas ósseas.