A cinética de hibridização é diferente dentro das células

É geralmente esperado que a cinética das reações dentro das células vivas difira da situação em soluções em grande escala. O emaranhamento macromolecular e as interações específicas de ligação podem alterar as propriedades de difusão e a disponibilidade de moléculas livres. Seu impacto na cinética de reação no contexto relevante de células vivas ainda é elusivo, principalmente devido à dificuldade de capturar cinéticas rápidas in vivo. Este artigo mostra medições espacialmente resolvidas da cinética de hibridização de DNA em células vivas individuais. Células HeLa foram transfectadas com uma sonda de dsDNA marcada com FRET por lipofecção. Caracterizamos a cinética da reação de hibridização com um intervalo cinético de 10 micros a 1 s por meio de uma combinação de oscilações de temperatura acionadas a laser e imagem de fluorescência estroboscópica. A constante de tempo da hibridização dependia da concentração de DNA dentro de células individuais e entre células. Uma análise quantitativa da dependência de concentração revelou cinéticas aceleradas várias vezes em comparação com solução livre para uma sonda de 16 bp e cinéticas desaceleradas para uma sonda de 12 bp. Não encontramos efeitos significativos de agentes de emaranhamento na cinética de hibridização in vitro. Nossos resultados sugerem que as taxas de reação in vivo são especificamente moduladas por interações de ligação para as duas sondas, possivelmente acionadas por seus diferentes comprimentos. Em geral, a modalidade de imagem apresentada de microscopia de bloqueio óptico de oscilação de temperatura permite investigar interações biomoleculares em diferentes compartimentos celulares em células vivas para biologia de sistemas.