Uso de uma técnica de seleção para identificar a diversidade de locais de ligação para o fator de transcrição RAP1 da levedura

Utilizamos a técnica conhecida como ligação selecionada e amplificada (SAAB) para isolar locais de ligação para o fator de transcrição RAP1 da levedura a partir de um pool degenerado de oligonucleotídeos. Um total de 47 sequências foi isolado, das quais duas mostraram ser locais de ligação contaminantes não-RAP1. Após excluir essas duas sequências, o restante das sequências foi usado para derivar um novo local de ligação consensual para RAP1. O novo consenso 5' A/G T A/G C A C C C A N N C C/A C C 3' é uma extensão significativa do consenso existente (4). É mais longo por dois pares de bases na extremidade 5' e é significativamente mais restrito na extremidade 3'. Uma análise das combinações de incompatibilidades nas sequências individuais do SAAB, em comparação com o local de ligação consensual do RAP1, nos permitiu analisar a estrutura do local de ligação do RAP1 em algum detalhe. O local de ligação pode ser subdividido em três regiões; um local de ligação central, uma região flanqueadora 5' e uma região flanqueadora 3'. O local de ligação central, consistindo na sequência 5'CACCCA3', é crítico para o reconhecimento pelo RAP1. As regiões flanqueadoras menos conservadas não são tão importantes. Interações entre o RAP1 e essas regiões provavelmente estabilizam a interação entre o RAP1 e o local de ligação central. Cada uma das sequências isoladas na análise do SAAB foi usada para pesquisar a liberação 78 do banco de dados de DNA EMBL+GenBank. As pesquisas identificaram 102 locais de ligação potenciais para o RAP1 dentro dos promotores de genes de levedura.