Aumentando a Estabilidade de Fragmentos de PCR e os Rendimentos de Proteínas em um Sistema Sem Células com Extratos de Escherichia coli Geneticamente Modificados

A síntese de proteínas sem células de Escherichia coli é um sistema altamente produtivo que pode ser aplicado à expressão em alta capacidade a partir de produtos de reação em cadeia da polimerase (PCR) em placas de 96 poços para estudos proteômicos, bem como para a evolução de proteínas. No entanto, a instabilidade do DNA linear parece ser uma grande limitação do sistema. Modificamos o genoma da cepa A19 de E. coli removendo o gene endA que codifica a endonuclease I e substituindo o operon recCBD (no qual recD codifica a exonuclease V) pelo sistema de recombinação do fago lambda. Usar o extrato celular desta nova cepa aumentou a estabilidade dos produtos de PCR amplificados a partir de um plasmídeo contendo o gene cat. Isso resultou na produção de CAT (acetiltransferase de cloranfenicol) a partir de produtos de PCR comparável àquela proveniente de plasmídeos (500-600 microg/ml) em uma reação em lote. Mostramos que as reações de síntese de proteínas sem células usando produtos de PCR amplificados a partir de DNA genômico e estendidos com o promotor T7 e o terminador T7 apresentam os mesmos altos rendimentos de proteínas (550 microg/ml) em placas de 96 poços. Com este sistema, foi possível expressar rapidamente uma variedade de proteínas citoplasmáticas e periplasmáticas.