Regulação da calcineurina pela fosforilação

O sítio na calcineurina, a fosfatase de proteína dependente de Ca2+/calmodulina (CaM), que é fosforilada pela quinase de proteína dependente de Ca2+/CaM tipo II (quinase CaM tipo II) foi identificado. Análises da liberação de 32P a partir de peptídeos tríticos e brometo de cianogênio derivados de 32Pcalcineurina, além da determinação direta da sequência estabeleceu o sítio como -Arg-Val-Fen-Ser(PO4)-Val-Leu-Arg-, que se conformava à sequência de fosforilação consensual para a quinase CaM tipo II (Arg-X-X-Ser/Thr-). Este sítio de fosforilação está localizado na extremidade C-terminal do domínio presumido de ligação à CaM na calcineurina (Kincaid, R. L., Nightingale, M. S. e Martin, B. M. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 8983-8987), explicando assim a inibição observada dessa fosforilação quando Ca2+/CaM está ligado à calcineurina. Uma vez que a sequência do sítio de fosforilação também contém elementos dos determinantes de especificidade para a quinase de proteína dependente de Ca2+/fosfolipídio (quinase de proteína C) (resíduos básicos tanto N-terminal quanto C-terminal a Ser/Thr), testamos a calcineurina como um substrato para a quinase de proteína C. A quinase de proteína C catalisou uma fosforilação estequiometrica rápida, e as características da reação foram as mesmas que com a quinase CaM tipo II: 1) a fosforilação foi bloqueada pela ligação de Ca2+/CaM à calcineurina; 2) a fosforilação inativou parcialmente a calcineurina, aumentando o Km (de 9,9 +/- 1,1 para 17,5 +/- 1,1 microM de cadeia leve de miosina marcada com 32P); e 3) a 32Pcalcineurina exibiu uma desfosforilação autônoma muito lenta, mas foi rapidamente desfosforilada pela fosfatase de proteína IIA. O mapeamento de peptídeos tríticos e termolíticos com 32P e a análise sequencial da sequência de fosfoaminoácidos confirmaram que a quinase de proteína C e a quinase CaM tipo II fosforilaram o mesmo sítio.